F-box 蛋白是最大的調節蛋白家族之一，在蛋白質(zhì)降解中起重要作用。在植物中，F 蛋白在功能上非常多樣化，只有一小部分被詳細表征。本文鑒定了一種新型 F-box 蛋白 FBX92 作為擬南芥葉片生長(cháng)的抑制劑。AtFBX92 的過(guò)度表達導致植物的葉子比野生型小，而AtFBX92水平降低的植物則通過(guò)刺激細胞增殖而增加葉片生長(cháng)。詳細的細胞分析表明，AtFBX92 特別影響早期葉片發(fā)育過(guò)程中的細胞分裂速率。AtFBX92水平降低的植物中幾個(gè)細胞周期基因表達水平的增加支持了這一點(diǎn)。而玉米同源基因ZmFBX92 在玉米中的過(guò)表達對植物生長(cháng)沒(méi)有影響，而擬南芥中的異位表達增加了葉子的生長(cháng)。截斷形式的 AtFBX92 的表達表明，ZmFBX92和AtFBX92在擬南芥中功能增益的對比效應是由于ZmFBX92基因中缺少F-box相關(guān)結構域。我們的工作揭示了復雜網(wǎng)絡(luò )中的另一個(gè)參與者，它決定了葉子的大小并為識別假定的底物奠定了基礎。

ZmFBX92OE和WT植物的表型分析顯示，轉基因植物的葉面積顯著(zhù)較大，其他表型正常（圖1）。在標準和輕度滲透脅迫條件下體外生長(cháng)的WT和ZmFBX92OE植株的預計花環(huán)面積（PRA）在分層后6天至21天（DAS）確定（圖1A）。平均而言，脅迫在21 DAS 時(shí)使花環(huán)面積減少了約 60%。在兩種條件下，ZmFBX92OE 植物與WT相比具有顯著(zhù)增加的花環(huán)面積（圖1A）。ZmFBX92OE 對擬南芥葉片大小的積極影響通過(guò)確定22 DAS時(shí)的單個(gè)葉面積得到證實(shí)（圖1B、C）。ZmFBX92OE 植物的成熟葉和幼葉都較大。為了檢查細胞增殖和/或細胞擴增的差異在多大程度上導致葉片尺寸增加，在WT和ZmFBX92OE葉片中比較了背面表皮細胞的數量和尺寸。ZmFBX92OE 植物中*成熟（22DAS）的第三片葉子由于細胞數量的高度增加（約70%）而增大了約30%，這部分被細胞大小減少約20%（圖1D）所補償。因此，ZmFBX92 在擬南芥中的異位表達導致葉片變大，主要是由于細胞數量增加。

與異位表達ZmFBX92的植物所觀(guān)察到的相反，與WT植物相比，AtFBX92OE 植物的花環(huán)面積減少（圖 2A）。這種減少在輕度滲透脅迫下相當。在A(yíng)tFBX92OE植物中沒(méi)有觀(guān)察到其他明顯的表型。從6個(gè)DAS開(kāi)始，在發(fā)育的早期就已經(jīng)可以看到減小的花環(huán)大?。▓D 2A）。AtFBX92過(guò)表達對葉生長(cháng)的負面影響通過(guò)測定體外生長(cháng)的 22 天齡植物的單個(gè)葉面積得到證實(shí)。與WT相比，AtFBX92OE7植物的成熟葉面積顯著(zhù)較小，而對于A(yíng)tFBX92OE2 植物，所有葉子都顯著(zhù)較小，包括幼葉（圖2B、C）。為了探索葉片尺寸減小的細胞基礎，在細胞水平上分析了體外生長(cháng)的 AtFBX92OE 和WT植物的葉片發(fā)育。與ZmFBX92OE的情況類(lèi)似，第三片葉子背面表皮的細胞數量和細胞大小在21 DAS時(shí)確定，此時(shí)這片葉子*成熟（圖2D）。AtFBX92OE2和AtFBX92OE7的成熟第三葉分別比WT小45%和16%，這是由于細胞數量大幅減少，部分補償通過(guò)增加的單元尺寸。

圖1.（左圖）ZmFBX92表達對擬南芥花環(huán)和葉片生長(cháng)的影響以及葉片大小差異的細胞基礎

圖2.（右圖）在標準體外條件下AtFBX92異位表達對花環(huán)和葉片生長(cháng)的影響以及葉片大小差異的細胞基礎

圖3.（左圖）體外標準條件下AtFBX92 下調對花環(huán)和葉片生長(cháng)的影響以及葉片大小差異的細胞基礎

圖4.（右圖）體外標準條件下AtFBX92del 表達對花環(huán)和葉片生長(cháng)的影響以及葉片大小差異的細胞基礎

與過(guò)度表達AtFBX92的植物平行，通過(guò)使用以下工具設計靶向AtFBX92的人microRNA（amiRNA），產(chǎn)生表達水平降低的轉基因植物。對三個(gè)表達水平降低的純合、獨立、單基因座系的葉片表型進(jìn)行了分析，由于它們非常相似，因此僅給出了amiFBX92-4（以下稱(chēng)為amiFBX92）的結果（圖3。從DAS的第5天到第21天測定PRA，并顯示amiFBX92中的PRA比分析第一天起的WT更大（圖3A）。在輕度滲透脅迫下，PRA的增加具有可比性。接下來(lái)，在21 DAS測定單個(gè)葉面積。除amiFBX92的葉片3外，所有葉片均顯著(zhù)大于WT的葉片（圖3B，C）。21 DAS時(shí)*成熟的第一對葉的細胞分析表明，葉面積的（24%）是由于細胞數量增加（47%），部分由細胞大小減?。?6%）補償（圖3D）。綜上所述，我們的數據表明改變AtFBX92表達水平以相反的方式影響葉片大小，這主要是細胞數量差異的結果。

PRA 隨時(shí)間的定量圖像分析，從 6 DAS 到 24 DAS，表明 AtFBX92del 植物比 WT 大（圖 4A）。 此外，PRA 增加在發(fā)育過(guò)程中很早就開(kāi)始（圖 4A），類(lèi)似于ZmFBX92OE 和 amiFBX92 品系中觀(guān)察到的效果。與此一致，在 20 DAS 確定的單個(gè)葉面積顯著(zhù)大于 WT（圖 4B、C）。 一致地，在 20 DAS 時(shí)第一對葉的大小增加（27%）是由于細胞數量增加（29%），而對細胞大小沒(méi)有顯著(zhù)影響（圖 4D）。

圖5.在標準和干旱脅迫條件下，AtFBX92錯誤表達對土壤中生長(cháng)的植物葉片大小的影響

為了驗證在體外觀(guān)察到的AtFBX92表達水平改變的植物花環(huán)大小的差異，在自動(dòng)成像平臺 WIWAM 上的土壤中種植了AtFBX92OE、amiFBX92、AtFBX92del和相應的WT植物。分析了每個(gè)構建體的兩條線(xiàn)。本文也可以證實(shí)，在土壤中AtFBX92OE植物比WT小，而amiFBX92和AtFBX92del植物更大，盡管對于A(yíng)tFBX92del植物這只能在兩條線(xiàn)之一中得到證實(shí)（圖 5A）一般來(lái)說(shuō)，土壤中的影響似乎不如體外顯著(zhù)，因為與WT的絕對百分比差異在體外總是大于在土壤中。通過(guò)向培養基中添加甘露醇，在滲透脅迫條件下生長(cháng)的 AtFBX92OE和amiFBX92植物PRA減少與在這些條件下生長(cháng)的WT植物的PRA減少沒(méi)有顯著(zhù)差異。向生長(cháng)培養基中添加甘露醇通常在實(shí)驗室環(huán)境中用作滲透脅迫的代表。由于土壤種植植物的反應更接近自然條件，還評估了輕度干旱脅迫對AtFBX92水平改變的土壤種植植物和WT植物的影響（圖 5B）。